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無(wú)細(xì)胞百日咳攻擊菌的制備及液氮保存材料和方法
時(shí)間:2019-05-13 10:29來(lái)源: 作者:班德液氮罐 點(diǎn)擊:
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1、 材料 自增壓液氮罐
1.1分裝容器
凍存管：4306592.0ml corning incorporated，cor-ning，NY14831 Made in Mexico。
1.2保護(hù)劑及培養(yǎng)基
甘油：分析純。
蛋白胨水、活性炭半綜合培養(yǎng)基和改良包-姜羊血培養(yǎng)基，由長(zhǎng)春生物制品研究所培養(yǎng)基室提供。
1.3菌種
百日咳攻擊菌種株18323由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。
2、方法
2.1攻擊菌的制備
2.1.1 菌種復(fù)蘇及傳代 將菌種在無(wú)菌條件下復(fù)蘇、溶解、混勻、傳到包$姜羊血培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)72h，同時(shí)作純菌試驗(yàn)。合格后傳二代經(jīng)37℃培養(yǎng)48h，用活性炭半綜合培養(yǎng)基傳三代、四代、五代、六代、七代、八代、九代，37℃培養(yǎng)24h。
2.1.2保護(hù)劑的制備 將甘油加入蛋白胨水中制成含10%甘油的蛋白胨水，混勻滅菌。
2.1.3 菌懸液的制備 將各代菌液分別刮入裝有ph7.2緩沖生理氯化鈉溶液的大試管中，制成菌懸液并混勻，同時(shí)作純菌試驗(yàn)，測(cè)定菌液濃度。
2.2攻擊菌的分裝
將菌懸液用含10%甘油的蛋白胨水稀釋至27億/ml，分裝于滅菌的凍存管中，每管1.5～1.8ml。
2.3攻擊菌保存
為防止細(xì)胞急劇冷凍后在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，降低存活率，所以每分鐘下降1℃的慢速凍結(jié)至-30℃。然后迅速放入液氮保藏器內(nèi)的-150℃氣相中，最后浸入到-196℃液氮中。
2.4攻擊菌的檢定
2.4.1攻擊菌復(fù)蘇 將凍存管從液氮罐中取出立即放入38～40℃的水浴中進(jìn)行急劇解凍，直到全部融化為止。
2.4.2攻擊菌稀釋 打開(kāi)凍存管，將攻擊菌用生理氯化鈉溶液稀釋成每稀釋度含80000、8000、800、80和8個(gè)菌。
2.4.3攻擊途徑及劑量 每稀釋度（0.03ml）腦腔攻擊10只小鼠，每稀釋度分別攻擊80000個(gè)菌、8000個(gè)菌、800個(gè)菌、80個(gè)菌、8個(gè)菌。自增壓液氮罐
1.1分裝容器
凍存管：4306592.0ml corning incorporated，cor-ning，NY14831 Made in Mexico。
1.2保護(hù)劑及培養(yǎng)基
甘油：分析純。
蛋白胨水、活性炭半綜合培養(yǎng)基和改良包-姜羊血培養(yǎng)基，由長(zhǎng)春生物制品研究所培養(yǎng)基室提供。
1.3菌種
百日咳攻擊菌種株18323由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。
2、方法
2.1攻擊菌的制備
2.1.1 菌種復(fù)蘇及傳代 將菌種在無(wú)菌條件下復(fù)蘇、溶解、混勻、傳到包$姜羊血培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)72h，同時(shí)作純菌試驗(yàn)。合格后傳二代經(jīng)37℃培養(yǎng)48h，用活性炭半綜合培養(yǎng)基傳三代、四代、五代、六代、七代、八代、九代，37℃培養(yǎng)24h。
2.1.2保護(hù)劑的制備 將甘油加入蛋白胨水中制成含10%甘油的蛋白胨水，混勻滅菌。
2.1.3 菌懸液的制備 將各代菌液分別刮入裝有ph7.2緩沖生理氯化鈉溶液的大試管中，制成菌懸液并混勻，同時(shí)作純菌試驗(yàn)，測(cè)定菌液濃度。
2.2攻擊菌的分裝
將菌懸液用含10%甘油的蛋白胨水稀釋至27億/ml，分裝于滅菌的凍存管中，每管1.5～1.8ml。
2.3攻擊菌保存
為防止細(xì)胞急劇冷凍后在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，降低存活率，所以每分鐘下降1℃的慢速凍結(jié)至-30℃。然后迅速放入液氮保藏器內(nèi)的-150℃氣相中，最后浸入到-196℃液氮中。
2.4攻擊菌的檢定
2.4.1攻擊菌復(fù)蘇 將凍存管從液氮罐中取出立即放入38～40℃的水浴中進(jìn)行急劇解凍，直到全部融化為止。
2.4.2攻擊菌稀釋 打開(kāi)凍存管，將攻擊菌用生理氯化鈉溶液稀釋成每稀釋度含80000、8000、800、80和8個(gè)菌。
2.4.3攻擊途徑及劑量 每稀釋度（0.03ml）腦腔攻擊10只小鼠，每稀釋度分別攻擊80000個(gè)菌、8000個(gè)菌、800個(gè)菌、80個(gè)菌、8個(gè)菌。自增壓液氮罐
